Aplikace molekulárně biologických metod při detekci genů a degradaci vybraných mikrobiálních metabolitů v potravinách

Abstract

Tato disertační práce je zaměřena na detekci a kvantifikaci bakteriálních genů kódujících enzymy, jež se podílí na degradaci biogenních aminů (BA). Teoretická část předkládané práce pojednává o toxicitě BA, jejich výskytu v potravinách, faktorech, které se podílí na jejich vzniku i možnostech degradace těchto bakteriálních metabolitů. Zvláště se pak zabývá molekulárně biologickými metodami aplikovanými v potravinářství, které jsou efektivně využívány pro kontrolu producentů či degradérů těchto významných nízkomolekulárních dusíkatých látek. V experimentální části práce byla ověřována schopnost vybraných kmenů degradovat BA a na základě získaných poznatků byly navrženy primery (pro cílové i "housekeepingové" geny) pro dva bakteriální druhy: Bacillus subtilis a Lactobacillus casei. V rámci testů byly vybrány vhodné sady primerů (u kterých reakce běžely téměř se 100% efektivitou, netvořily se žádné dimery nebo nespecifické produkty) pro sledování genové exprese cílových genů (yobN kódující aminooxidázu u druhů B. subtilis; a MCO kódující "multi-copper" oxidázu u druhů L. casei), jež kódují enzymy podílející se právě na degradaci BA. K relativní kvantifikaci obou cílových genů (yobN, MCO) byly využívány optimalizované metodiky kvantitativní real-time PCR s reverzní transkripcí (RT-qPCR). U kmenů B. subtilis byla zaznamenaná nejvyšší genová exprese, cílového genu kódujícího aminooxidázu (yobN), v exponenciální fázi růstu (3,03 +- 0,13). Tento výsledek byl podpořen sledováním úbytku (degradací) BA v MM1, pomocí metody HPLC/UV, kdy bylo zaznamenáno snížení histaminu o 17 % a kadaverinu o 18 % u kmenu CCM 2216 během 48 hodin. Dále byla prokázána 18% degradace tyraminu u kmenu CCM 2267 během 48 hodin v tomtéž médiu. Výsledky dále naznačily, že degradace BA pomocí druhu B. subtilis může být ovlivněna tvorbou spór. I u kmenu L. casei CCDM 198 byla sledována genová exprese (relativní kvantifikace) cílového genu MCO v čase. Nejvyšší hodnota 5,04 +- 0,45 byla rovněž zaznamenaná v exponenciální fázi růstu, přičemž úbytek sledovaných BA činil 21,22 +- 4,17 %. Později byl testován i vliv redoxních činidel 1% cysteinu (w/v) a 0,1% kyseliny askorbové (w/v) na expresi genu kódujícího "multi-copper" oxidázu, tedy enzymu podílejícího se na degradaci BA. Z výsledků vyplývá, že 1% cystein (w/v) pozitivně ovlivnil růst bakterií, v důsledku čehož mírně vzrostla degradace BA (22,64 +- 3,13 %). Zatímco po přídavku 0,1% kyseliny askorbové (w/v) následoval pokles množství bakterií, exprese cílového genu i nižší degradace BA ve všech sledovaných časech. V závěru experimentu bylo ověřeno, že kmen CCDM 198 degraduje sledované BA i v reálné potravině . UHT mléce.